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Soutenance de thése de Ali Ibrahim

Lundi 9 mars 2015 à 13h30

par Valérie PLOUVIN - publié le

Ali Ibrahim : Doctorant au sein du Laboratoire d’Océanologie et de Géosciences (LOG) soutiendra publiquement sa thèse intitulée :

Microscopie linéaire et non linéaire pour l’étude du stress chez les copépodes

Date : lundi 9 mars 2015 à 13h30

Lieu : Amphi IRI/IRCICA à Villeneuve d’ Ascq

Directeur de thèse :

- Sami SOUISSI

- Bernard VANDENBUNDER

Co-encadrant :

- Laurent HELIOT

Rapporteurs :

- Isabella BUTTINO

- Francois TIAHO

Membre :

- Darine ABI HAIDAR

- Corinne LAPLACE-BUILHE

- Alain LEPRETRE

Résumé :

Les copépodes sont des petits crustacés de longueur autour de 1 mm en stade adulte. Leurs réponses à différents facteurs de stress tels que la salinité et la température peuvent être observées à différentes échelles d’organisation allant du gène, cellule jusqu’à l’organisme. Jusqu’à présent, aucune observation des effets de stress de température ou de salinité sur les copépodes n’a été faite par microscopie optique Dans ce travail, nous avons mis en œuvre pour l’étude de ces copépodes les techniques de microscopie et en particulier de microscopie non linéaire : la microscopie confocale à balayage laser (CLSM) pour l’étude des molécule autofluorescente tel que les Flavines, la technique d’imagerie complémentaire : par absorption biphotonique (TPEF) et par Génération de Seconde Harmonique (SHG) pour l’étude de la structure des myofibrilles et l’imagerie Raman en mode CARS pour l’étude des signatures des liaisons intermoléculaires. Avec ces techniques nous avons pu étudier, caractériser et quantifier les effets de stress appliqués sur le copépode calanoïde Pseudodiaptomus marinus maintenu en culture pendant plusieurs générations dans le laboratoire à des conditions favorables et stables de salinité (30 psu) et de température (18 °C). Ces différents stress appliqués sont : une forte diminution de la température (18 à 4 ° C), des diminutions mineure et majeure de la salinité (de 30 respectivement à 15 PSU et à 0 PSU) et enfin, un stress mélangé d’une baisse simultané de la température et de la salinité (de 18 ° C et 30 psu à 4 ° C et 0 PSU). Nos observations ont été concentrées sur le muscle du copépode.
Les variations morphologiques détectées par CLSM sont comme suit :
-  Au niveau de la carapace : Le stress salinité majeur (18 ° C, 0psu) et le stress mixte (4 ° C, 0psu) ont provoqué aussi des fissures dans la carapace.
-  Au niveau des muscles : Une augmentation significative de la distance moyenne entre les sarcomères de 2,06 +/- 0,11 µm à 2,44 +/- 0,42 µm et 2,88 +/- 0,45 µm a été observée respectivement après le stress salinité majeur et le stress mixte. Dans le stress salinité mineure nous avons constaté une disparition du signal lié aux sarcomères.
Cette étude a été complétée par la technique SHG/TPEF qui nous a répondu à quelques questions à propos de la disparition des stries musculaires. Cette technique a été suivie par la technique de transformation de Fourier (FFT) appliquée sur les profils des stries musculaires pour mieux comprendre l’état des stries dans chaque stress.
Enfin, nous avons appliqué la microscopie CARS qui a été développée dans notre laboratoire à l’imagerie de ces échantillons. Avec cette technique d’imagerie on a pu identifier les stries musculaires et les réserves lipidiques. D’après les résultats obtenus par les techniques CLSM, SHG/TPEF on a trouvé que les marqueurs de stress les plus remarquables sont présente dans les deux stress salinité majeur et mixte au niveau des muscles et des carapaces. C’est la raison pour laquelle on a choisis une de ces deux stress pour étude sous microscope CARS c’est le stress salinité majeur puisqu’il est plus probable d’arriver dans la nature.
Cette approche peut être facilement généralisée à d’autres espèces de copépodes pour détecter les changements morphologiques résultant des diverses contraintes qu’ils peuvent rencontrer dans leur environnement.

Copepods are small crustaceans with length about 1mm in adult stage. Their responses to different external strain factors such as salinity and temperature can be observed at different scales from genes to organism (individual).
Until now, no observation of the effects of temperature or salinity stresses on copepods has been done by light microscopy
In this work we exploited optical imaging techniques and specifically nonlinear microscopy : Confocal Laser Scanning microscopy (CLSM) to study of autofluorescent molecules such as Flavins, complementary non Linear Optical microscopy techniques : Two Photons Excitation Fluorescence (TPEF) and Second Harmonic Generation techniques (SHG) to investigate the structure of the myofibrils and finaly, Raman imaging in CARS mode. These techniques allow studying, characterisation and quantifying stress effect applied on calanoid Pseudodiaptomus marinus copepod maintained during several generations in the laboratory at favorable and stable condition of salinity (30 psu) and temperature (18° C). These stresses applied were : a sharp decrease in temperature (18 to 4°C), a moderate and a major decrease in salinity (from 30 respectively to 15 psu and 0 psu), and finally a mixed stress with a decrease both in temperature and salinity (from 18°C and 30 psu to 4°C and 0 psu). Our observations are concentrated on copepod muscles regions. The morphological variations detected by CLSM were as follow :
-  At the shell : The major haline stress (18°C, 0psu) and the mixed stress (4°C, 0psu) caused also cracks in the cuticles.
-  At muscles : A significate increase in the average distance between sarcomeres from 2.06 +/- 0.11 µm to 2.44 +/- 0.42 µm and to 2.88 +/- 0.45µm was observed respectively after the major haline stress (18°C, 0psu) and the mixed stress (4°C, 0psu). In the minor haline stress we noted a disappearance of sarcomeres.
This study has been completed with SHG/TPEF techniques to answer some questions about stripes disappearance. This technique was followed by Fourier transformation (FFT) applied on the stripes muscles profiles to more understanding about stripes situations in each stress.
Finally, we applied CARS microscopy which was developed in our laboratory to image these samples. With this technique we were able to identify these muscles stripes and also lipid reserves.
According to the results obtained by CLSM and SHG / TPEF techniques it was found that the most remarkable stress markers are present in both major haline and mixed stress in the muscles and the shells. That is why we have chosen one of these two stresses to be observed by CARS microscope and it was major haline stress since it is most probably to happen in nature.
This approach can be easily generalized to other copepod species to detect the morphological changes resulting from the various stresses they can encounter in their environment.